家蚕BmHSP20.8蛋白线粒体定位机制及分子伴侣功能的研究

【摘要】热休克蛋白(Heatstressprotein,HSP)是一类广泛存在各种生物中的蛋白质,是生物体或细胞在受到不良刺激时高效表达的一类蛋白。热休克蛋白不仅在应激条件下高表达,在正常情况下的组织中也广泛存在。随着家蚕(Bombyxmori)基因组测序的完成,家蚕小分子热休克蛋白(smallHSP,sHSP)的研究也有了许多新进展。目前对家蚕sHSP功能的研究甚少。家蚕热休克蛋白基因BmHSP20.8的ORF框大小为561bp,编码186个氨基酸,亚细胞定位预测结果发现BmHSP20.8有51%可能性定位于线粒体,13%可能性定位在细胞的其它位置,29%可能性分泌到胞外。本研究进一步通过实验方法鉴定和研究了BmHSP20.8蛋白的亚细胞定位及其机制,并对其分子伴侣活性和互作蛋白进行研究。为了鉴定BmHSP20.8蛋白的亚细胞定位情况,我们将BmHSP20.8基因克隆到pIEx-1昆虫表达载体进行HIS标签融合表达,为了直观的观测该蛋白在细胞中的分布情况,我们进一步构建了带EGFP标签的BmHSP20.8真核表达载体。将构建好的载体转染家蚕BmN细胞,72小时后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布情况,并提取细胞的胞质和线粒体蛋白,Westernblot分析该蛋白的定位情况。结果表明BmHSP20.8蛋白只存在于线粒体中,而胞质中没有检测到该蛋白的存在,显示BmHSP20.8蛋白只在线粒体中特异性表达。同时,与EGFP融合表达结果显示,当EGFP位于BmHSP20.8蛋白C端时,融合蛋白只存在于胞质中,而当EGFP位于BmHSP20.8蛋白N端时,融合蛋白在胞质和线粒体蛋白中均能检测到,表明BmHSP20.8蛋白的线粒体定位信号位于该蛋白的COOH端。为了进一步确定BmHSP20.8蛋白的线粒体定位信号区域,我们构建了带有EGFP标签的截短型BmHSP20.8真核表达载体,表达的EGFP和截短BmHSP20.8融合蛋白可用于蛋白的定位信号区域鉴定。将截短型载体转染家蚕细胞,72小时后提取胞质和线粒体蛋白,Westernblot分析蛋白的定位情况。结果表明,BmHSP20.8蛋白的线粒体定位信号区域由该蛋白基因ORF框的427bp-561bp区域编码,位于该蛋白C端的143aa-186aa区域。分子伴侣活性是HSP蛋白的重要功能活性。为了研究BmHSP20.8蛋白的分子伴侣功能,首先我们通过和SUMO的融合成功实现了该蛋白的可溶表达,纯化和ULP1酶切获得BmHSP20.8蛋白,表达蛋白经胰蛋白酶(trypsin)敏感实验,在较短时间内被完全水解,表明此蛋白未形成稳定的寡聚体结构。通过柠檬酸合酶(CS)的热聚集实验证实BmHSP20.8蛋白具有分子伴侣活性。这一结果为研究家蚕小热休克蛋白功能奠定基础。BmHSP20.8蛋白定位于细胞线粒体中,可能和其它线粒体蛋白相互作用从而行使其分子伴侣等生物学功能。我们将构建好的pIEX-1-BmHSP20.8载体转染家蚕BmN细胞,采用HISpulldown方法用HIS单抗对BmHSP20.8蛋白进行免疫共沉淀,利用鼠IgG作阴性对照,成功免疫共沉淀出BmHSP20.8蛋白及结合蛋白。将免疫共沉淀后的蛋白样品进行SDS-PAGE检测,银染结果发现HIS单抗免疫共沉淀的样品中,在100-130kDa之间有一条特异性的条带,而在鼠IgG免疫共沉淀对照中却无此条带,表明在100-130kDa之间存在与BmHSP20.8相互作用的蛋白,为后续互作蛋白的鉴定奠定基础。
【作者】王婵；
【导师】聂作明；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】BmHSP20.8；线粒体；分子伴侣；免疫共沉淀；

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